RIP技术(RNA Binding Protein Immunoprecipitation,RNA结合蛋白免疫沉淀),是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术。分析与目的蛋白结合的RNA。运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来,然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA进行分析;即用抗体或表位标记物捕获细胞核内或细胞质中内源性的RNA结合蛋白,防止非特异性的RNA的结合,免疫沉淀把RNA结合蛋白及其结合的RNA一起分离出来,结合的RNA序列可通过microarray(RIP-Chip),定量RT-PCR或高通量测序(RIP-Seq)方法来鉴定。是了解转录后调控网络动态过程的有力工具,能帮助我们发现miRNA的调节靶点。
1. 细胞裂解液获取
2. 磁珠的准备
3. RNA结合蛋白免疫沉淀
4. RNA纯化
1. 贴壁细胞:用胰酶将细胞消化下来,或用细胞刮将细胞刮下来,将培养液在室温条件下1000转/分,离心10分钟,弃上清留细胞沉淀,干冰运输。
2. 悬浮细胞:将培养液1000转/分,离心10min。弃上清留细胞沉淀,干冰运输。
3. 细胞上清:3000转/分,离心15min取上清,上清立即用于实验,或分装后于-20℃或-80℃保存。避免反复冻融。