Bulked-segregant analysis简称BSA，也叫混合分组分析，是一种利用样本混池的建库方式对动植物的极端性状进行QTL定位的一种方法。这种方法快速便捷，在亲本群体中选择表型极端的个体构建表型极端的子代群体，并对极端性状的子代群体进行混池测序，从而迅速定位到与目标基因具有紧密连锁的分子标记区域，进一步挖掘重要的功能基因。Graded-seq是升级版的BSA，可对多个混池DNA进行分析。
取样类型：具有重要极端性状的亲本，子代群体包括暂时分离群体F1、F2和永久分离群体RIL、NIL和DH
混池规模：子代数量最少30+30个起，推荐数量50+50个起。必须符合极端性状的要求。
测序深度：亲本测序深度最低20x起，推荐深度30x起。平均每个子代1x起，推荐2x起。
Q1：混池数量有要求吗？
A：子代混池数量最少30个起，建议至少50个。理论上混池数量越多，性状定位越好。如果极端性状的样本数量不多不建议强行凑样，最低至少也要达到20个左右。两种极端性状的混池数量可以不一致。
Q2：没有亲本，只有RIL群体或者是F2群体，可以做BSA吗？
A：可以做。联川生物会采用ED分析法进行分析。但是定位区间内的候选基因会偏多。
A：建议老师亲本测序深度至少要10x-20x以上，推荐30x以上。子代混池，平均每个子代至少要1x以上，推荐2x以上。理论上测序深度越深，标记的准确性会越强。
A：是的。Mutmap仅限于EMS等化学诱变剂引起的点突变。
A：可以的。如果没有参考基因组可以做BSA但是后期数据关联性较差，不太推荐做BSA，做简化基因组遗传图谱较为合适。另外针对一些没有参考基因组但是基因组杂合度较高的物种如牡丹，推荐做BSR混池。
A：我们不建议老师使用动物样本做BSA混池，这里的动物不包括鱼、昆虫等物种。但是我们一般会优先推荐植物，二倍体和多倍体都是可以做混池的。
快捷高效的BSA混池测序鉴定水稻抗稻瘟病QTL
研究背景
使用传统的育种方法鉴定某个重要的农艺性状存在费时费力等缺点，采用BSA策略可以通过对性状差异较大的亲本进行杂交，快速构建作图群体如F2、RIL等。在亚洲水稻是一种十分重要的粮食作物，鉴定重要农艺性状的相关基因迫在眉睫。
来自日本的Terauchi教授和他的同事们，利用抗稻瘟病的水稻品系Nortai和感病水稻品系Hitomebore（图a）杂交后得到F2群体，之后连续自交得到总计241株水稻（RIL群体）。之后按照不同的抗病能力对RIL群体进行分级（图b），将抗病能力最强的20株水稻和抗病能力最弱的20株水稻分别构建2个混池（图c）。
SNP-index和基因组位置关系图可以看出，抗病混池（R-bulk）和感病混池（S-bulk）的SNP-index在6号染色体上差异较大。△SNP-index（R-S bulk）可以看出，染色体上绝大部分区域的△SNP-index都接近于0，而2.39-4.39Mb这段区域的△SNP-index都大于0.79且p<0.01（图d）。
接下来作者使用最传统的遗传图谱法，对所有241株水稻进行QTL定位，发现0-4.9Mb内LOD值最高，去交集后抗稻瘟病的区域进行快速定位。
Takagi H, Abe A, Yoshida K, et al. QTL-seq: rapid mapping of quantitative trait loci in rice by whole genome resequencing of DNA from two bulked populations. Plant J, 2013, 74(1):174.
Reads比对到参考基因组后，可以计算碱基的覆盖到基因组上的比例。参考基因组上被reads覆盖到的碱基数占基因组的百分比称为基因组覆盖度；碱基上覆盖的reads数为覆盖深度。
使用GATK进行SNP Calling和Indel Calling，接下来使用ANNOVAR对SNP和Indel结果进行注释。
根据亲本和混池的SNP及Indel标记，利用SNP-Index和ED分析方法同时进行标记与性状的关联分析，获得与目标性状相关的基因。
使用联川生物自主开发的富集分析程序，对目标性状区域内的候选基因进行功能富集分析。
