荧光素酶(luciferase)是自然界中能够产生生物荧光的酶的总称,其中最有代表性的是从甲虫中分离得到的萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase)和从海肾中分离得到的海肾荧光素酶(Renilla luciferase)。由于两种酶底物和发光颜色的区别,且在动物体内无内源性表达,使其在双报告实验中得到广泛应用。荧光素酶作为一种理想的报告基因,可用于启动子研究、miRNA研究、信号转导通路研究等。
1 构建报告基因质粒的构建
2 质粒转染细胞,筛选阳性克隆
3 报告基因质粒与转录因子表达质粒共转染细胞
4 提取蛋白加入底物,测定荧光素酶的活性
5 计算相对荧光强度
1、血清样本(干冰运输)
将收集好的全血,静置1~2小时,直接低速离心分离出血清待用或保存(-20℃或-80℃)。
2、血浆样本(干冰运输)
收集抗凝全血,轻轻颠倒充分抗凝后,可直接低速离心分离血浆(也可静置半小时左右再低速离心分离血浆)待用或保存(-20℃或-80℃)。
3、组织样本
取组织块(0.1g~0.2g)最少可到2~5mg在冰冷的生理盐水中漂洗,除去血液,滤纸拭干,准确称重,放入5ml的匀浆管中。按重量:体积=1:9的比例加入匀浆介质或者0.86%的生理盐水于匀浆管中,冰水浴条件下,用眼科小剪尽快剪碎组织块,进行匀浆。将制备好的匀浆液用普通离心机或低温低速离心机2500转/分左右,离心10~15分钟,取上清液进行测定。制备好的匀浆液建议不要冻存,最好当天进行测定,如放置时间过长相关酶活会有所下降。
4、细胞样本
贴壁细胞:用胰酶将细胞消化下来,或用细胞刮将细胞刮下来,将培养液在室温条件下1000转/分,离心10分钟,弃上清留细胞沉淀,干冰运输。
悬浮细胞:将培养液1000转/分,离心10min。弃上清留细胞沉淀,干冰运输。
细胞上清:3000转/分,离心15min取上清,上清立即用于实验,或分装后于-20℃或-80℃保存。避免反复冻融。