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RNA原位杂交实验

服务介绍:

原位杂交的原理是含有互补序列(探针)的被标记的单链DNARNA片段在适当 的条件下与细胞的DNARNA杂交形成稳定的杂交体。无论是DNA(dsDNA、寡核苷酸和ssDNA)或是RNA(SSC RNA)探针均能用于定位DNAmRNA,并且均能用于两个主要类型的标记策略:直接标记,即用报道分子(如同位素)附着于DNARNA;间接标记,在该法中将半抗原(如生物素或地高辛)附着于探针上,然后用标记的结合蛋白(如亲合素)检测或者用特异性的抗体检测靶探针杂交体

产品结果展示:

实验流程:

1. 组织固定:组织取出洗净后立即放入固定液(DEPC水配制)中固定2-12 h。

2. 脱水:组织固定完成后经梯度酒精脱水后浸蜡,包埋。

3. 切片:石蜡经切片机切片,摊片机捞片,62℃烤箱烤片2 h。

4. 石蜡切片脱蜡至水

5. 消化:根据组织固定时间长短,切片于修复液中煮沸10-15min,自然冷却。后基因笔画圈,根据不同组织不同指标特性,滴加蛋白酶K(20ug/ml) 37℃消化

6. 预杂交:滴加预杂交液,37°C孵育1 h。

7. 杂交:倾去预杂交液,滴加含探针杂交液, 恒温箱37°C杂交过夜。

8. 杂交后洗涤:洗去杂交液,2×SSC,37°C洗10 min,1×SSC,37°C洗10 min,0.5×SSC室温洗10 min。若非特异杂交体较多,可以增加甲酰胺洗涤。

9.  DAPI复染核:切片滴加DAPI染液,避光孵育8 min,冲洗后滴加抗荧光淬灭封片剂封片。

10. 镜检拍照:切片于尼康正置荧光显微镜下观察并采集图像。(紫外激发波长330-380 nm,发射波长420 nm,发蓝光;FAM(488)绿光激发波长465-495 nm,发射波长515-555 nm,发绿光;CY3红光激发波长510-560 nm,发射波长590 nm,发红光)DAPI染核,为蓝光。

送样运输要求:

1. 冰切。标本放原位杂交固定液中,常温运输;冰冻切片-20°运输。

2. 石蜡。标本放原位杂交固定液中,常温运输;石蜡切片常温运输。

3. 细胞爬片。细胞爬片加原位杂交固定液固定15 min后,密封,4°C运输。共聚焦皿

4. 新鲜组织:组织取出后可以立即冷冻处理,后干冰运输到武汉进行后续冰冻切片处理。新鲜组织-80°C保存。

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