外泌体是指包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡(30-150nm),现今,其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。
早期的研究认为,外泌体执行蛋白运输功能,特异靶定受体细胞,交换蛋白和脂类或引发下游信号事件。直到2007年,研究人员发现外泌体也运输核酸,参与细胞间通讯。总之,其蛋白、RNA和脂肪成分特异,且携带了一些重要的信号分子,有望在多种疾病的早期诊断中发挥作用,这使得外泌体的市场也在快速扩展,并成为热门的研究对象。
外泌体由于携带的蛋白质不同,而能够发挥不同的生物学功能。目前研究发现,外泌体内含有与细胞来源相关的蛋白质rRNA和microRNA,并且外泌体能够通过生物屏障,在细胞间传递功能性核酸分子,从而发挥各种生物学功能,故外泌体有望成为一种新型给药途径及基因治疗载体。外泌体携带蛋白质包括源细胞非特异性和源细胞特异性两类蛋白分子。前者可能与外泌体的生物发生和生物学作用有关,主要包括:细胞溶质蛋白、参与细胞内信号转导的蛋白、各种代谢酶、热休克蛋白和四跨膜蛋白;另一类是特殊蛋白质,这类蛋白质只存在于某种特殊的细胞分泌的外泌体,而这些特定细胞源的外泌体与其生物学功能有着密切联系。
1. 外泌体的提取
2. 外泌体的分析
1、血清样本(干冰运输)
将收集好的全血,静置1~2小时,直接低速离心分离出血清待用或保存(-20℃或-80℃)。
2、血浆样本(干冰运输)
收集抗凝全血,轻轻颠倒充分抗凝后,可直接低速离心分离血浆(也可静置半小时左右再低速离心分离血浆)待用或保存(-20℃或-80℃)。
3、组织样本
取组织块(0.1g~0.2g)最少可到2~5mg在冰冷的生理盐水中漂洗,除去血液,滤纸拭干,准确称重,放入5ml的匀浆管中。按重量:体积=1:9的比例加入匀浆介质或者0.86%的生理盐水于匀浆管中,冰水浴条件下,用眼科小剪尽快剪碎组织块,进行匀浆。将制备好的匀浆液用普通离心机或低温低速离心机2500转/分左右,离心10~15分钟,取上清液进行测定。制备好的匀浆液建议不要冻存,最好当天进行测定,如放置时间过长相关酶活会有所下降。
4、细胞样本
贴壁细胞:用胰酶将细胞消化下来,或用细胞刮将细胞刮下来,将培养液在室温条件下1000转/分,离心10分钟,弃上清留细胞沉淀,干冰运输。
悬浮细胞:将培养液1000转/分,离心10min。弃上清留细胞沉淀,干冰运输。
细胞上清:3000转/分,离心15min取上清,上清立即用于实验,或分装后于-20℃或-80℃保存。避免反复冻融。